醛基化海藻多糖复合材料作为人工肝载体的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4660-4667.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.014

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醛基化海藻多糖复合材料作为人工肝载体的可行性

于美丽，杜智，韩涛，王雅蓉，陈靖，郭宏玥，李楠，安帅星

天津市第三中心医院，天津市人工细胞重点实验室，天津市 300170

收稿日期:2012-12-18 修回日期:2013-03-27 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
通讯作者: 杜智，教授，天津市第三中心医院，天津市人工细胞重点实验室，天津市 300170 tjsdszxyyyjs@163.com
作者简介:于美丽，女，1959年生，天津市人，汉族，1982年南开大学毕业，研究员，主要从事生物医用高分子材料研究。 yumeili8@163.com
基金资助:
天津市科委应用基础研究基金项目(11JCYBJC27700)；天津市卫生局科技基金项目(2011KR06)。

Aldehyde seaweed polysaccharide composites serve as artificial liver carriers

Yu Mei-li, Du Zhi, Han Tao, Wang Ya-rong, Chen Jing, Guo Hong-yue, Li Nan, An Shuai-xing

Tianjin Artificial Cell Key Laboratory, the Third Center Hospital of Tianjin, Tianjin 300170, China

Received:2012-12-18 Revised:2013-03-27 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
Contact: Du Zhi, Professor, Tianjin Artificial Cell Key Laboratory, the Third Center Hospital of Tianjin, Tianjin 300170, China tjsdszxyyyjs@163.com
About author:Yu Mei-li, Researcher, Tianjin Artificial Cell Key Laboratory, the Third Center Hospital of Tianjin, Tianjin 300170, China yumeili8@163.com
Supported by:
the Applied Basic Research Foundation of Tianjin Municipal Science and Technology Commission, No. 11JCYBJC27700; the Science and Technology Foundation of Tianjin Health Bureau, No. 2011KR06

摘要/Abstract

摘要：

背景：三维肝细胞体外培养中肝细胞可在支架孔隙中良好生长，但酶消化脱细胞过程严重影响了细胞获得率和活性。
目的：制备大孔三维细胞支架N-聚异丙基丙烯酰胺-醛基化海藻多糖，探索其作为人工肝生物反应器细胞载体的可行性。
方法：以海藻酸钠为致孔剂合成大孔N-聚异丙基丙烯酰胺，再交联醛基化海藻多糖，制备出大孔三维细胞支架N-聚异丙基丙烯酰胺-醛基化海藻多糖。测定其孔径及孔隙率。①细胞毒性实验：MTT法检测在新鲜细胞培养液、高密度聚乙烯浸提液、高密度聚氯乙烯浸提液及N-聚异丙基丙烯酰胺-醛基化海藻多糖浸提液中培养小鼠成纤维细胞的A值。②非酶脱细胞性能实验：将第3代小鼠成纤维细胞接种到盛有N-聚异丙基丙烯酰胺-醛基化海藻多糖支架的6孔板中，实验组通过降温脱附回收细胞，对照组以胰蛋白酶消化回收细胞。
结果与结论：大孔三维细胞支架N-聚异丙基丙烯酰胺-醛基化海藻多糖的孔径为(180.23±62.30) μm，孔隙率为(89.67±2.40)%。细胞毒性实验证明N-聚异丙基丙烯酰胺-醛基化海藻多糖支架无细胞毒性；培养第15天实验组非酶温控脱细胞与对照组酶消化脱细胞相比细胞获得率增加26.24%。表明大孔三维细胞支架N-聚异丙基丙烯酰胺-醛基化海藻多糖具有适宜细胞生长的大孔结构；温度调控脱细胞性能克服了传统酶消化脱细胞对细胞的损伤，可提高细胞培养的数量和质量。

关键词: 生物材料, 组织工程复合支架材料, N-聚异丙基丙烯酰胺, 醛基化海藻多糖, 大孔三维细胞支架, 非酶温控脱细胞, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: During the three-dimensional culture in vitro, hepatocytes can grow well in the pores of the scaffold, but enzymatic digestion for decellularization severely affects cell survival rate and activity.
OBJECTIVE: To prepare a macroporous scaffold, N-poly-isopropyl acrylamide-aldehyde seaweed polysaccharides, and to investigate the feasibility of this scaffold as a cell carrier for artificial liver bioreactor.
METHODS: Sodium alginate as the porogen was used to synthesize the macroporous N-poly-isopropyl acrylamide that was then cross-linked with aldehyde seaweed polysaccharides to prepare the macroporous three-dimensional cytoskeleton. Scaffold aperture and porosity were measured. (1) Cytotoxicity test: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay was used to detect absorbance values of mouse fibroblasts cultured in fresh cell culture medium, high-density polyethylene extract, high-density polyvinyl chloride extract and N-poly-isopropyl acrylamide-aldehyde seaweed polysaccharide extract. (2) Non-enzymatic acellular performance tests: The third generation of mouse fibroblasts cell line was inoculated into 6-well plates containing N-poly isopropylacrylamide-aldehyde seaweed polysaccharide scaffolds. In the experimental group, cells were recovered by cooling desorption, while in the control group, the cells were recovered using trypsin digestion method.
RESULTS AND CONCLUSION: The aperture and porosity of the macroporous scaffold were (180.23±62.30) μm and (89.67±2.40)%, respectively. Cytotoxicity test showed that the macroporous scaffold of N-poly-isopropyl acrylamide-aldehyde seaweed polysaccharide had no cytotoxicity. The cell survival rate in the experimental group was increased 26.24% than that in the control group. These findings indicate that the three-dimensional macroporous cytoskeleton, N-poly-isopropyl acrylamide-aldehyde seaweed polysaccharide, has a macroporous structure suitable for cell growth, and thermo-responsive acellular performance overcomes cellular damage resulting from traditional enzymatic digestion and promotes the number of quality of cultured cells.

Key words: biomaterials, tissue-engineered composite scaffold, N-poly isopropyl acrylamide, aldehyde seaweed polysaccharides, three-dimensional macroporous cytoskeleton, non-enzymatic thermostat decellularization, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

于美丽，杜智，韩涛，王雅蓉，陈靖，郭宏玥，李楠，安帅星. 醛基化海藻多糖复合材料作为人工肝载体的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4660-4667.

Yu Mei-li, Du Zhi, Han Tao, Wang Ya-rong, Chen Jing, Guo Hong-yue, Li Nan, An Shuai-xing. Aldehyde seaweed polysaccharide composites serve as artificial liver carriers [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4660-4667.

图/表（结果） 7

2.1 大孔三维支架PNIPA-Am-OSA的表征 图1为海藻多糖与OSA红外谱图。

海藻多糖醛基化后在1 737 cm^-1处出现了醛基C=O振动吸收峰。由于邻二醇结构被部分氧化为醛或酮结构，使羟基缔合程度减弱。结果显示，-OH伸缩振动频率有所升高，波数由3 325 cm^-1升高到3 363 cm^-1。因此，通过红外谱图分析，可以看出海藻多糖经过高碘酸钠氧化后确实生成了醛基。

图2为大孔三维支架PNIPA-Am-OSA及OSA红外谱图，PNIPA-Am-OSA除保留OSA的特征谱带外，在 1 645.21 cm^-1及1 552.46 cm^-1处为酰胺键的特征吸收，1 175，1 132 cm^-1处的异丙基骨架振动吸收反映了异丙基的特征吸收；PNIPA-Am-OSA中3 508.26 cm^-1和 3 431.20 cm^-1处的峰消失，表明-NHNH₂基团参与了反应；红外分析结果证明PNIPA-AM共聚物与OSA 反应，-NHNH₂与-CHO脱水形成席夫碱。

2.2 大孔三维支架PNIPA-Am-OSA的扫描电镜结果 图3为大孔三维支架PNIPA-Am-OSA扫描电镜图片，结果显示PNIPA-Am-OSA支架具有相互联通且孔径在100-300 μm的大孔结构，这种结构有利于水分和营养物质的输送，且通过水分对流的方式，能使支架具有较快的溶胀和去溶胀速度。

2.3 大孔三维支架PNIPA-Am-OSA的孔隙率及平均孔径 见表1。

结果显示，大孔三维支架的平均孔隙率在88%左右，在一定范围内改变致孔剂海藻酸钠的用量对其影响不大。作为大孔三维支架材料，其孔隙率和平均孔径相对比较大，可以满足细胞所需的营养物质的输送及代谢产物排放的要求。

2.4 大孔三维支架PNIPA-Am-OSA的细胞毒性 MTT检测结果显示，大孔三维支架PNIPA-Am-OSA样品提取液组ATCC CCL1细胞的相对增殖率在 89%以上，没有表现出细胞毒性；用 DMEM 浸泡处理3次(10 min/次)后， ATCC CCL1细胞的相对增殖率达到98%，证明大孔三维支架PNIPA-Am-OSA生物相容性良好。

2.5 大孔三维支架PNIPA-Am-OSA不同脱细胞方法的比较结果 实验组与对照组不同时间收获细胞数量比较，见表2。

此外，在培养过程中光镜下观察细胞在大孔三维支架PNIPA-Am-OSA呈紧密排列，见图4。

MTT比色法检测细胞增殖活力，利用酶标仪测定570 nm处的吸光度A值，各个时间点实验组与对照组收获细胞增殖活力比较见表3，由表可见实验组比对照组细胞增殖活力稍高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

在生物人工肝和肝细胞移植研究中，如何获得足够数量、活性优良、可维持细胞特异性功能表达的肝细胞已经成为主要问题。细胞三维培养作为体外高密度细胞培养技术已被广泛用于生物医学领域。目前国内外在肝细胞三维培养研究方面取得了较大的进展，使体外肝细胞培养密度明显增加，肝细胞功能维持时间明显延长。研究者对各种胞外支架材料进行了研究，包括聚乙烯树脂、海藻酸盐、聚氨酯泡沫等。证明在一定的培养条件下，肝细胞在支架孔隙中生长良好；然而脱细胞需要酶消化技术，这对细胞的获得率和活性有一定的影响。

温敏性高分子材料能根据周围温度的变化发生性质上的改变，当温度升高到某一值以上时会发生从溶胀透明状态到消溶胀不透明状态的变化，在这一温度附近的溶胀比变化往往可达几倍到几十倍。如果将溶胀温度降到这一温度以下，凝胶状态能发生可逆变化，这一温度称为该材料的最低临界共溶温度(lower critical solution temperature，LCST)^[1]。

在温敏性高分子材料的研究中，N-聚异丙基丙烯酰胺(N-poly-isopropyl acrylamide，PNIPA- Am)由于其独特的热敏性能成为研究的热点。日本Yamada教授制造了一种温敏性的培养基底，是将PNIPA-Am聚合到普通的细胞培养皿表面上^[2]。由于PNIPA-Am的LCST为32 ℃，在正常培养条件37 ℃下培养皿表面是疏水性，并且细胞在其上的黏附与生长与在普通培养皿上是相似的。然而，当培养温度低于LCST 32 ℃时，聚合物表面变成亲水性且开始膨胀，在基底表面和培养的细胞之间形成了一层水化层，从而促使细胞从表面分离。而这个过程并不需要酶处理，例如胰蛋白酶。由于避免了酶的使用，一些重要的细胞表面蛋白质，如离子通道、生长因子受体及胞间接合蛋白保持了完整，因此细胞和细胞外基质可作为完整的一片被得到^[3]。

温敏性高分子材料并不只局限于PNIPA-Am，只要所选择的高分子材料 LCST 符合要求，都能被研究人员用于制造温敏性培养基底。中国台湾 Chen 教授的研究小组利用壳聚糖与PNIPA-Am在聚苯乙烯表面的共聚合成功培养出了成纤维细胞的细胞片^[4]。德国Wischerhoff 教授的研究小组利用 poly(OEGMA-CO- MEO2MA)在镀金表面的聚合制造出了温敏性培养基底，其能控制细胞的黏附和脱离^[5]。日本Okano教授利用PNIPA-Am和聚乙二醇在聚苯乙烯表面的不同部分聚合制造出了可调控黏附区域的温敏性培养基底。通过调整PNIPA-Am在培养基底上的区域可得到不同用途的细胞片形状^[6]。

实验在参考上述学者特别是日本学者Okano细胞片层理论基础上，结合作者醛基化多糖和聚酯类三维细胞载体的研究工作基础，利用PNIPA-Am的温敏特性和醛基化海藻多糖(aldehyde seaweed polysaccharides, OSA)的细胞基质特性，选择天然海藻酸钠为致孔剂，研究制备非酶脱细胞大孔三维细胞支架PNIPA-Am- OSA。通过对PNIPA-Am-OSA支架孔径、孔隙率的测定，细胞毒性实验及非酶脱细胞性能分析的测定，确定适宜细胞生长、分化的大孔三维支架材料，探索其作为人工肝生物反应器细胞支架的可行性。

材料方法

设计：新型PNIPA-Am-OSA大孔三维载体细胞培养及温控脱细胞实验。

时间及地点：于2010年10月至2012年2月在天津市第三中心医院，天津市人工细胞重点实验室完成。

材料：ATCC CCL1(NCTC clone 929 小鼠成纤维细胞)，购自中国科学院细胞库。

PNIPA-Am-OSA作为人工肝三维多孔细胞载体可行性实验的试剂与仪器：

Main reagents and instruments:

实验方法：

大孔PNIPA-Am的合成反应：

大孔PNIPA-Am的合成路线：

按摩尔比80∶20∶0.5将单体N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯和引发剂偶氮二异丁腈溶于无水乙醇，将0.75 g致孔剂海藻酸钠溶于15 mL 生理盐水溶液中^[7]，加入反应体系中混合均匀。通N₂ 30 min，置于冰水浴中反应24 h，升温至50 ℃下反应16 h，然后将温度升高到65 ℃，搅拌，并开始滴加联胺溶液(联胺的摩尔数为丙烯酸甲酯的5倍)，12 h后停止反应，除去溶剂。所得产物在45 ℃热水浴中浸泡24 h，并且每隔2 h换一次水，产物真空干燥至恒质量，产率为73.2%。

OSA的制备及最佳氧化度筛选：

海藻多糖醛基化反应方程：

参考文献[8]方法制备OSA；配质量分数为2%的海藻酸钠水溶液100 mL，然后按不同摩尔比(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶10，1∶12)加入高碘酸钠，避光磁力搅拌下反应24 h，24 h后加入0.4 mL乙二醇终止反应 15 min，终止液加入4 g NaCl，混匀5 min，按体积比 1∶5倒入无水乙醇中沉淀、析出，将沉淀物取出，真空抽吸，自然干燥。干燥后样品再次溶于去离子水中，用3 500 u孔径透析袋进行透析，过夜，透析后样品液经冷冻干燥后得终产物OSA。

OSA最佳氧化度筛选：

OSA氧化度测定方法：按参考文献[9]采用碘化钠-淀粉糊精法建立标准曲线y=675.15x-0.141 7(R²= 0.976 1)。取氧化24 h的海藻酸钠溶液2.5 mL，迅速加入工作液2.5 mL，避光作用50 min后在480 nm处测定吸光度值，最后根据标准曲线计算出高碘酸钠消耗量。

采用 MTT法检验不同氧化度OSA的细胞毒性，结果显示随着氧化度的增加，细胞毒性也随着增加；氧化度<24%的OSA无细胞毒性，这与Gao等^[10]报道的氧化度小于30%的时候具有非细胞毒性结果相一致，故实验采用24%氧化度的OSA作为反应原料。

大孔三维支架PNIPA-Am-OSA制备：

PNIPA-Am-OSA的合成路线：

PNIPA-Am-OSA的合成原理：上述所合成的大孔PNIPA-Am共聚物为直线型大分子，由于联胺取代共聚物链段上的甲氧基，得到带有许多-NHNH₂官能团的大分子PNIPA-AM；海藻多糖G单元上相邻的两个-OH易被氧化成-CHO，用NaIO₄氧化海藻多糖，得到醛基化的OSA。大孔PNIPA-AM共聚物与OSA 反应，-NHNH2 与-CHO 脱水形成席夫碱，通过交联反应形成大孔三维支架PNIPA-Am-OSA。

PNIPA-Am-OSA的合成方法：将10%OSA(24%氧化度)，18%大孔PNIPA-AM共聚物，溶于0.1 mol/L四硼酸钠与pH值7.4的PBS中，经席夫碱交联反应1 h，得到PNIPA-AM-OSA大孔三维支架。

扫描电镜观察大孔三维支架PNIPA-Am-OSA：将制备的大孔三维支架PNIPA-Am-OSA在-20 ℃冷冻48 h。然后用冷冻干燥机干燥。经离子溅射仪喷金后用扫描电镜观察支架形貌。在扫描电镜图片中随机取20个孔计算支架孔径。

大孔三维支架PNIPA-Am-OSA孔隙率的测定：采用无水乙醇替代法测定多孔支架的孔隙率。取出支架，测量其体积V1，称质量m1，然后将材料放入一定体积的无水乙醇中，使乙醇进入材料内部，使其达到饱和不再有气泡逸出，取出称质量m2，无水乙醇的密度记为ρ。多孔支架的孔隙率 P 为：

大孔三维支架PNIPA-Am-OSA的细胞毒性实验：

大孔三维支架PNIPA-Am-OSA浸提液的制备：按每0.2 g样品加入1 mL生理盐水的比例将无菌的待测样品加入生理盐水中，37 ℃放置72 h即可制备浸提液。同法制备高密度聚乙烯片及聚氯乙烯片浸提液。

细胞培养：将配制好的1×10⁷L^-1 ATCC CCL1细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板中，设空白对照、阴性对照、阳性对照和样品组，每组8孔，每孔加入100 μL细胞悬液。在37 ℃、体积分数5%CO₂、100%相对湿度的恒温培养箱中培养 24 h，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入商品化的高密度聚乙烯片浸提液，阳性对照组加入聚氯乙烯片浸提液，样品组加入大孔三维支架PNIPA-Am-OSA浸提液，每孔100 μL，置恒温培养箱中继续培养72 h。每孔加入 20 μL 5 g/L MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入150 μL二甲亚砜，利用酶标仪在570 nm波长下测定吸光度，按下式计算细胞相对增殖率。

大孔三维支架PNIPA-Am-OSA不同脱细胞方法的比较^[11-15]：将培养到第3代1 5×10⁷L^-1ATCC CCL细胞分别接种到盛有PNIPA-Am-OSA支架的6孔板中，实验组与对照组各6孔，隔2 d进行换液，换液前倒置显微镜下观察两组细胞生长状况。所培养的细胞在增殖到一定数量，实验组通过降温至20-22 ℃脱附，回收细胞；对照组按常规酶消化加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化，吸弃胰蛋白酶液，使用含体积分数10%胎牛血清的培养液终止消化，回收细胞。用血细胞计数板计数和MTT比色法检测细胞增殖活力^[16-19]，比较两组细胞数量和活性程度。

主要观察指标：大孔三维细胞支架PNIPA-Am-OSA的孔径及孔隙率；大孔三维细胞支架PNIPA-Am-OSA的细胞毒性；大孔三维细胞支架PNIPA-Am-OSA的非酶脱细胞分析结果。

统计学分析：采用SPSS 17.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，统计学差异检验标准P < 0.05。

讨论

目前，细胞三维培养已广泛用于基础生物学和生物医学研究，与单层、二维培养相比，它的主要优点是具有良好的结构，能直接反映结构与功能的关系，而且细胞的形态和微环境更接近体内的状态^[20]。作为细胞载体的支架材料应具备良好的孔隙率，可促进细胞增殖、分化及细胞外基质的生成，利于营养物质和代谢产物的扩散，来源广泛，价格合适等优点。

与人工合成材料相比，天然生物组织材料由于来源于生物体本身，其结构和成分与活体组织更为相似，有许多独特的优点。生物材料与细胞亲和性强，能为细胞生长、增殖、分化及功能发挥提供近似体内组织发生发育的细胞外基质支架条件，使细胞聚集形成组织，控制组织结构，调节细胞表型。生物型支架材料与周围受体自身相容性好，但生物材料细胞支架的机械强度、孔隙率和温度智能调控不及合成材料，为此实验设计将合成材料PNIPA-Am和生物高分子材料OSA相结合，探索新型大孔三维细胞支架的可行性。

大孔三维支架PNIPA-Am-OSA具有温敏性能，是因为PNIPA-Am链段的温度敏感特性引起^[21-22]，实验证明随PNIPA-Am量的增加，PNIPA-Am-OSA对温度更加敏感；随疏水性单体MA量的增加，PNIPA-Am-OSA的LCST会降低；海藻多糖的氧化度对大孔三维支架的温敏性能影响不大，但对细胞毒性有一定影响，实验证明OSA氧化度<24%的大孔三维支架无细胞毒性。

由于氧化海藻多糖具有与蛋白多糖相似的结构、良好的亲水性、生物相容性，而且聚糖类物质也是肝细胞外基质的主要成分，所以实验设计选择氧化海藻多糖作为肝细胞黏附生长的支架制备原材料。

利用N-异丙基丙烯酰胺的LCST为32 ℃这一特性，交联制备的大孔三维支架PNIPA-Am-OSA在正常细胞培养条件37 ℃下具有疏水性，细胞在其上的黏附与生长与多层普通培养皿相似；而当培养温度降低于30- 32 ℃时，其表面变成亲水性，并且开始膨胀，在表面和培养的细胞之间形成了水化隔层，促使细胞脱附。而这个过程并不需要酶的消化处理，保持重要的细胞表面蛋白质不受损伤。实验证明PNIPA-Am-OSA支架培养第15天非酶温控脱细胞与酶消化脱细胞相比细胞获得率增加26.24%，而且细胞活性有所提高。

三维支架材料常常模拟其自然对应物体内的细胞外基质，既起物理支架的作用，又是细胞在体外培养黏附物质^[23-24]。如何制备适合细胞生长的孔隙结构支架，包括适当的孔隙尺寸，以及孔隙的贯通性等是研究的重点之一。贯通性三维支架多孔结构有利于细胞生长和培养液的进入，接触面积增加，细胞可以在孔内生长，以保证材料深部的细胞有营养供给，同时起到支撑作用^[25-28]。海藻酸钠是一种分子链中电荷密度较高的天然高分子电解质，具有无毒、生物相容性好和生物可降解等特点，在盐水溶液中分子链间的排斥作用会减弱，进而发生分子链卷曲。实验利用海藻酸钠为致孔剂，在NaCl 溶液中制备具有温敏性的大孔三维支架，结果用扫描电镜证实了PNIPA-Am-OSA具有多孔结构，孔径达(180.23±62.3)μm，孔隙率为(89.67±2.40)%。

经细胞毒性实验证明大孔三维支架PNIPA-Am- OSA上ATCC CCL1细胞的相对增殖率达可到98%，说明其生物相容性良好。上述工作为课题进一步研究在大孔三维支架PNIPA-Am-OSA上进行肝细胞增殖培养奠定了基础。

醛基化海藻多糖复合材料作为人工肝载体的可行性

Aldehyde seaweed polysaccharide composites serve as artificial liver carriers

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